革兰阳性菌质粒小提试剂盒

　　革兰阳性菌质粒小提试剂盒

　　产品及特点

　　本试剂盒用于革兰氏阳性（G+）细菌小量制备质粒 DNA 。本产品基于改良后的碱 变性法，首先菌体经溶菌酶破壁，然后菌体经碱裂解、高盐、低 pH 处理，质粒可从菌体 中释放出来，并特异、高效地被离心吸附柱吸附。通过清洗液的洗涤可去除杂质，在低 盐、高 pH 条件下洗脱，得到纯度较高的质粒 DNA。使用本试剂盒每次可处理 1- 4 ml 过夜培养的菌液，所得质粒可直接用于酶切、转化、PCR、测序及转染等各种分子生物学 实验。

　　它具有下列特点：

　　1. 快捷、高效：操作简便，得率高，节约时间；

　　2. 纯度高：沉淀致密，去杂干净。约时间。

　　保存条件

　　在室温(15-25℃)干燥条件下，可保存 12 个月；更长时间的保存可置于 2-8℃ 。若溶 液产生沉淀，应在使用前置于37℃下溶解沉淀。加入 RNase A 后的 Buffer S1 应置于 2-8℃ 保存，可稳定保存 6 个月。

　　使用方法

　　1. 从筛选平板上挑取单菌落至含抗生素的培养基中，37℃震荡培养 12-16 小时（摇 床转速 200-300）。

　　(注 意：建议使用 LB 培养基，营养更丰富的培养基会使菌体浓度过高，超过纯化系统处理能力而降 低 DNA 质量。另外，延长培养时间会因细胞死亡、裂解而造成质粒 DNA 浓度降低。)

　　2. 用 1.5 mL 离心管收集 1-4 mL 过夜培养饱和菌液，室温 12,000 rpm 离心 1 分钟，弃上清。

　　(次使用本试剂盒时，先将全部 RNase A 溶液全部加入到 Buffer S1 中，摇匀后再取用，未用完的溶液放 4℃保存。)

　　3. 加入 250 uL Buffer S1 ，旋涡震荡或用枪头充分吹打使菌体重悬。加入大约 5 mg 溶 菌酶干粉，轻柔颠倒混匀后室温放置 10 min 破裂细胞壁。

　　（注意：菌体沉淀一定要悬浮均匀，如有未彻底悬浮的菌块会影响裂解，导致提取的质粒浓度及纯度 降低）

　　4. 加入 250 μl Buffer S2 ，温和颠倒混匀使菌体完全裂解，直到溶液变成清亮、粘稠。

　　（注意：不可剧烈震荡， 以免造成基因组 DNA 段的污染）

　　5. 加入 350 μl Buffer S3，立即颠倒混匀，可见絮状沉淀物产生，然后 12,000 rpm 离心 3 min。

　　（注 意：Buffer S3 加入后应立即混合，避免产生局部沉淀）

　　6. 将上清液转移到离心吸附柱中，12,000 rpm 离心 30 sec ，弃收集管中滤液。

　　7. 加入 600 μl Buffer W2 ，室温 12,000 rpm 离心 30 sec ，弃收集管中滤液。

　　（注 意：Buffer W2 为浓缩液，按要求加入无水乙醇，用后应立即盖紧瓶盖， 以防酒精挥发）

　　8. 加入 500 μl Buffer W2 ，室温 12,000 rpm 离心 30 sec ，弃收集管中滤液。

　　9. 干燥。将离心吸附柱于 12,000 rpm 离心 2 min ，甩干残留漂洗液。

　　（注 意：此步不能省略，否则残留乙醇会影响质粒的后续使用）

　　10. 将吸附柱置于一新的无菌 1.5 ml 离心管（自备）中，加入 50-100 μl 的洗脱液 Buffer EB，室温 12,000 rpm 离心 1 min ，离心管底溶液即质粒 DNA。

　　（注 意：为增加洗脱效率，可将洗脱液在60℃预热。如需使用去离子水洗脱，可用NaOH 调整其pH 值在 7.0 - 8.5之间，为了增加质粒回收率，可将得到的溶液重新加入到离心管中，室温放置 2 min，再次离心收集）

　　注意事项

　　1. 细菌培养时间一般为 12-16 小时，如接种量大则应减少培养时间，过度培养会降低质粒 质量甚至导致质粒 DNA 突变。

　　2. 每次使用时都要注意 Buffer S2 和 S3 是否形成沉淀，如有沉淀 37℃溶解后再用。

　　3. 质粒的产量跟细菌量、质粒拷贝数、质粒大小和操作规范程度密切相关。