2SYBR qPCR Mix

　　 2SYBR qPCR Mix

　　产品及特点

　　2×SYBR qPCR Mix 是专用于染料法实时荧光定量 PCR 的预混体系，包含热启动 Taq DNA Polymerase 、PCR 扩增优化的稳定剂和增强剂、dNTPs 、SYBR Green I 荧光染料、 Mg2+等，操作简便，应用于基因组 DNA 靶序列和 RNA 反转录后 cDNA 靶序列的定量检 测。该试剂盒确保 DNA 或 cDNA 模板的准确定量，适用于各种类型荧光定量 PCR 仪。 它具有下列特点：

　　1. 高灵敏度：荧光染料 SYBR Green I 可以与所有的双链 DNA 结合，可以定量 低拷贝模板；

　　2. 高特异性：独特的 PCR 缓冲体系与热启动酶的组合，有效抑制非特异性的 PCR 扩增。

　　保存条件

　　-20℃可保存 12 个月。

　　使用方法

　　（注意： 以下举例为常规qPCR 反应体系和反应程序，实际操作中应根据模板、 引物结构和目的片 段大小不同进行相应的改进和优化）

　　1. 将DNA模板、引物、2×SYBR qPCR Mix、50 × ROX Reference Dye I/II溶解并置于冰 上备用。

　　2. 根据以下表格配置反应体系，总体积为20 μl。

　　（注意：a.通常引物浓度以 0.25 μM 可以得到较好结果，可以终浓度 0.1-1.0 μM 作为设定范围的参 考。扩增效率不高的情况下，可提高引物的浓度；发生非特异性反应时，可降低引物浓度，由此优化 反应体系 ；b.通常 DNA 模板的量以 10-100 ng 基因组 DNA 或 1-10 ng cDNA 为参照， 因不同物种的 模板中含有的目的基因拷贝数不同，可对模板进行梯度稀释， 以确定佳的模板使用量。)

　　需使用 ROX Reference Dye I 的机型：ABI Prism5700、7000、7300、7700、7900、7900HT、 7900HT Fast 、Step-One 、Step-One Plus。

　　需使用 ROX Reference Dye II 的机型：ABI Prism 7500/7500Fast 、ViiA7, Stratagene MX4000/MX3005P/MX3000P。

　　不需要使用 ROX 的机型：Bio-Rad CFX96, CFX384, iCycler iQ, iQ5, MyiQ, MiniOpticon, Opticon, Opticon 2, Chromo4; Cepheid SmartCycler; Eppendorf Mastercycler ep realplex, realplex 2 s; Illumina Eco qPCR; Qiagen/Corbett Rotor-Gene Q, Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000; Roche Applied Science LightCycler 480; Thermo Scientific PikoReal Cycler。

　　3. qPCR反应程序，两步法PCR：

　　预变性95℃3 min

　　35-40 cycles变性

　　退火/延伸95℃15 sec

　　60℃10-30 sec

　　熔解曲线分析，按仪器推荐程序

　　（注意：a.建议采用两步法 PCR 反应程序，若因使用 Tm 值较低的引物等原因，得不到良好的实验 结果时，可尝试进行三步法 PCR 扩增，退火温度请以56℃-64℃的范围作为设定参考；b.融解曲线分 析请以所使用的荧光定量 PCR 仪推荐的程序进行设定。）

　　4. 反应结束后确认荧光定量 PCR 的扩增曲线和融解曲线，进行 PCR 定量时制作标 准曲线等。

　　【引物设计原则】

　　1. PCR扩增产物长度： 80～150bp较为合适（可以至300bp）。

　　2. 引物GC含量：40～60%（45～55%理想）。

　　3. Tm 值：60～65℃ , 正反引物的Tm值不能相差太大。

　　4. 引物序列：A 、G 、C 、T 整体分布尽量均匀，不要有部分的GC rich或AT rich（特别 是 3’端）。避开T/C（Polypyrimidine）或A/G（Polypurine）的连续结构。

　　5. 3’末端序列：避免GC rich或AT rich。3’端碱基好为G或C。尽量避免3’末端碱基为 T。

　　6. 互补序列：避免引物二聚体的情况。两条引物间的3’末端避开有2个碱基以上的互补 序列。