MagPURE磁珠法质粒小提试剂盒

　　MagPURE磁珠法质粒小提试剂盒

　　本试剂盒适用于磁珠法质粒 DNA 的小量制备。菌体经碱裂解、高盐、低pH处理，质粒可从菌体中释放出来，并特异、高效地被磁珠吸附。再经蛋白清除液清洗，可将绝大多数菌体蛋白清除干净，然后通过清洗液的清洗可去除盐离子及其他杂质，高 pH 条件下洗脱得到高纯度的质粒 DNA。使用本试剂盒可从1 - 5 ml 过夜培养的菌液中纯化得到高达 30 μg 的质粒 DNA，所得质粒可用于常规分子生物学实验。

　　它具有下列特点：

　　1. 快捷、高效：操作简便，得率高，节约时间；

　　2. 纯度高：沉淀致密，去杂干净；

　　3. 磁珠法操作，可用于自动化提取。

　　保存条件

　　在室温(15 - 25℃)干燥条件下，可保存 12 个月；更长时间的保存可置于2 - 8℃。加入 RNase A 后的 Buffer S1 应置于 2 - 8℃保存，可稳定保存6 个月。

　　使用方法

　　1. 取 1 - 5 ml 过夜培养的菌液，室温 12,000 rpm 离心 1 min，尽量将上清去除干净。

　　（注 意：根据菌液的浓度决定取液量，浓度高时取 1.5 ml 菌液离心即可，浓度低时可多收集一次）

　　2. 加入 250 μl Buffer S1，旋涡震荡或用移液器充分吹打使菌体重悬均匀。

　　（注 意：菌体沉淀一定要悬浮均匀，如有未彻底悬浮的菌块会影响裂解，导致提取的质粒浓度及纯度降低）

　　3. 加入 250 μl Buffer S2，温和颠倒混匀使菌体完全裂解，直到溶液变成清亮、粘稠。

　　（注 意：不可剧烈震荡，以免造成基因组 DNA的污染，所用时间不要超过5 min，以免质粒受到破坏）

　　4. 加入 350 μl Buffer S4，立即颠倒混匀 6-8 次，12,000 rpm 离心5-10 min，小心将上清液转移到一干净的离心管中。

　　（注 意：Buffer S4 加入后应立即混合，避免产生局部沉淀；离心后如上清还有漂浮物可延长离心时间）

　　5. 加入 0.5 倍混匀，然后再加入 20 μl Magnetic Bead（磁珠），震荡混匀5min。（注 意：吸取磁珠时一定要混匀后再取）6. 将离心管置于磁力架上静置 1 min，磁珠完全吸附后，吸去液体。

　　7. 将离心管从磁力架上取下，加 500 μl Buffer W1，旋涡充分混匀30 s。

　　（注 意：Buffer W1 在使用前按要求加入无水乙醇，用后应立即盖紧瓶盖，以防乙醇挥发）

　　8. 将离心管置于磁力架上静置 1 min，磁珠完全吸附后，吸去液体。

　　9. 将离心管从磁力架上取下，加 600 μl Buffer W2，旋涡充分混匀30 s。

　　（注 意：Buffer W2 在使用前按要求加入无水乙醇，用后应立即盖紧瓶盖，以防乙醇挥发）

　　10. 将离心管置于磁力架上静置 1 min，磁珠完全吸附后，吸去液体。

　　11. 重复步骤 7 和 8 一次。

　　12. 将离心管置于磁力架上，开盖室温放置 5-10min。

　　（注意：乙醇残留会抑制后续的酶反应，所以晾干时要确保乙醇挥发干净。但也不要干燥过度，以免DNA 难以洗脱）

　　13. 将离心管从磁力架上取下，加入 50 - 100 μl Buffer EB，充分震荡1-2 min。

　　14. 将离心管置于磁力架上静置 1 min，磁珠完全吸附后，小心将溶液转移至新的离心管中，并于适当条件保存。

　　（注 意：为增加洗脱效率，可将洗脱液在 60℃预热。如需使用去离子水洗脱，可用NaOH调整其pH值在 7.0 - 8.5 之间）

　　低拷贝或大质粒（>10 kb）提取

　　如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10 kb 的大质粒，应加大菌体使用量，使用5- 10ml过夜培养物，同时按照比例增加 Buffer S1、S2、S3 的用量，洗脱液Buffer EB应在60℃水浴预热，在吸附和洗脱时可以适当延长时间，以增加提取效率。其它步骤相同。

　　注意事项

　　1. 细菌培养时间一般为 12 - 16 小时，如接种量大则应减少培养时间，过度培养会降低质 粒质量甚至导致质粒 DNA 突变。

　　2. 每次使用时都要注意 Buffer S2 和 S4 是否形成沉淀，如有沉淀37℃溶解后再用。

　　3. 注意溶液 S1，S2 和 S4 的用量比例，若细菌量增大，需按比例放大这些溶液的使用量。

　　4. 质粒的产量跟细菌量、质粒拷贝数、质粒大小和操作规范程度密切相关。